一、培養(yǎng)的貼壁動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)抽提步驟
1、從貼壁細(xì)胞培養(yǎng)瓶中小心傾去培養(yǎng)液。
2、預(yù)冷的PBS清洗貼壁的細(xì)胞2次,小心傾去PBS.
3、配置含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑( 1ml抽提試劑中加入5 μl蛋白酶抑制劑混臺(tái)液, 5 μl PMSF和5 μl磷酸酶混合液)。
4.、細(xì)胞瓶中加入預(yù)冷的含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑( 107個(gè)細(xì)胞中加入1ml抽提試劑; 5x 106個(gè)細(xì)胞中加入0.5ml抽提試劑) , 輕輕搖動(dòng)5分鐘。
5、用預(yù)冷的橡膠和塑料細(xì)胞刮將培養(yǎng)瓶壁上貼壁細(xì)胞刮下來(lái),轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸浮液到離心管中,冰浴下?lián)u動(dòng)15分鐘進(jìn)行裂解。
6、裂解液于預(yù)冷的離心機(jī)中14 , 000xg離心15分鐘。棄去沉淀，上清液立刻轉(zhuǎn)移入新的離心管中保存待用。
二、培養(yǎng)的懸浮動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)抽提步驟
1、2500xg離 心10分鐘沉淀懸浮的細(xì)胞,棄去上清液
2、預(yù)冷的PBS懸浮沉淀細(xì)胞, 2500xg離心10分鐘沉淀細(xì)胞,去上清。
3、配置含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑( 1ml抽提試劑中加入5蛋白酶抑制劑混合液, 5 μl PMSF和5 μ|磷酸酶混合液)。
4、加入含抑制劑的預(yù)冷蛋白質(zhì)抽提試劑( 107個(gè)細(xì)胞中加入1ml抽提試劑; 5x 106個(gè)細(xì)胞中加入0.5ml抽提試劑)
5、輕輕搖動(dòng)混和15分鐘進(jìn)行裂解。
6、裂解液于預(yù)冷的離心機(jī)中14 , 000xg離心15分鐘。棄去沉淀，上清液立刻轉(zhuǎn)移入新的離心管中保存待用。
三、哺乳動(dòng)物組織的蛋白質(zhì)抽提步驟
1、組織稱重,切小塊放入管中。
2、配置含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑( 1ml抽提試劑中加入5 μl蛋白酶抑制劑混臺(tái)液, 5 μl PMSF和5u|磷酸酶混合液)。
3、加入預(yù)冷的含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑( 250mg組織中加入1ml抽提試劑)。
4、用勻漿器每次30秒低速勻漿,每次勻漿間隔冰浴1分鐘,至組織*裂解。
5、裂解液于預(yù)冷的離心機(jī)中14 , 000xg離心15分鐘。上清液立刻轉(zhuǎn)移入 新的離心管中保存待用。